高速離心機的幾種分離方法

更新時間：2021-12-20 點擊次數(shù)：812

　　高速離心機主要用于將懸浮液中的固體顆粒與液體分開；或將乳濁液中兩種密度不同，又互不相溶的液體分開(例如從牛奶中分離出奶油)；它也可用于排除濕固體中的液體，例如用洗衣機甩干濕衣服；特殊的超速管式分離機還可分離不同密度的氣體混合物；利用不同密度或粒度的固體顆粒在液體中沉降速度不同的特點，有的沉降離心機還可對固體顆粒按密度或粒度進行分級。

　　高速離心機的幾種分離方法：

　　A．差速離心：逐次增加離心力，每次可沉降樣品溶液中的一些組份。

　　差速離心是一種zui常用的方法。在這種方法中，離心管在開始時裝滿了均一的樣品溶液。通過在一定速度下一定時間的離心后，就可得到兩個部份：沉淀和上清液。

　　通常在*次離心時把大部分不需要的大粒子沉降去掉。這時所需的組份大部分仍留在上清液中。然后將收集到的上清液以更高速度離心，把所需的粒子沉積下來。離心的時間要選擇得當，使大部份不需要的更小的粒子仍留在上清液中。對于得到的沉淀和上清液可以進行進一步的離心，直到達到所需要的分離純度為止。

　　差速離心的特點是操作簡單，但分離純度不高。

　　B．密度梯度離心法：可以同時使樣品中幾個或全部組份分離，具有很好的分辨率。

　　(1)速率區(qū)帶法：

　　根據(jù)樣品中不同粒子所具有的不同的尺寸大小及沉降速度(S)。大致步驟如下：

　　在離心管中裝入密度梯度溶液，溶液的密度從離心管頂部至底部逐漸增加(正梯度)。

　　將所需分離的樣品小心地加至密度梯度溶液的頂部。樣品在梯度溶液表面形成一負梯度。

　　由于不同大小的粒子在離心力作用下，在梯度中移動的速度不一樣，所以經(jīng)過離心后會形成幾條分開的樣品區(qū)帶。

　　注意：樣品粒子的密度必須大于梯度液注中任一點的密度。離心過程必須在區(qū)帶到達管子底部前停止。

　　(2)等密度離心法(isopycnic)：

　　根據(jù)粒子的不同密度來分離。離心過程中，粒子會移至與它本身密度相同的地方形成區(qū)帶。

　　密度樣度的選擇要使梯度的范圍包括所有待分離粒子的密度。樣品可以在密度梯度液粒上面或均勻分布在密度梯度中。經(jīng)離心后，樣品粒子達到它們的平衡點。

　　注意：平衡后粒子的分離*由其密度決定，與時間無關，此時再改變離心轉速，只能改變區(qū)帶的相對位置。

　　密度梯度分析法

　　(1)梯度介質性質與選擇：

　　A、應具備的性質：

　　梯度物質的選擇原則是滿足分離方法的基本要求，一個理想的密度材料標準它應是：

　　所形成的溶液密度應包括所需要的密度范圍。

　　具有某些性質，如折射率，據(jù)此可測定它的濃度。

　　所形成的溶液粘度低。

　　不損傷所分離的樣品。

　　離心分離后容易除去。

　　不妨礙分離積分的分析。

　　B、常用介質種類：

　　表一、常用梯度材料在20℃密度

　　B．梯度介質應用范圍：

　　表二、等密度梯度介質的應用

　　表三、各種大分子在蔗糖梯度液中的大約密度

　　(2)、梯度溶液的準備：

　　計算,稀釋

　　(3)梯度形狀

　　梯度形狀分：線型、等速型、階梯型、平坦型、陡峭型指數(shù)梯度。

　　梯度形狀對于分離是否成功非常重要：

　　zui常用的是線型梯度，適用于分離蛋白質、酶、激素、核糖體亞基和一些植物病毒；等速型適用于分離脂蛋白和一些需上浮分離樣品；不連續(xù)或階梯型梯度zui適用于分離整細胞、亞細胞組分以及純化一些哺乳類動物病毒或昆蟲病毒。等速梯度以及長液柱可增進分離能力，適用于分離核糖體亞基、多核糖體及植物病毒。

　　B．梯度柱制備：

　　梯度液柱可以用手工或梯度儀制備

　　半注法：

　　為縮減離心時間，或分離樣品較少可用半注法：下半管鋪置梯度介質，中間加樣品，上面鋪Buffer或液體石臘油。

　　(4)加樣方法與加樣量：

　　將樣品加到梯度液柱上，針尖和離心管成45-60°角度，慢慢地將樣品沿管壁流到液面上去，對于DNA一類易斷的脆弱樣品，應該用孔徑較大的移液管代替針頭，以避免剪切力對樣品的切割作用。樣品濃度是梯度柱zui小密度的1/10(W/W)。

　　(5)轉子的選擇與效應：

　　(6)分離區(qū)帶的回收及檢測

　　離心后所形成的區(qū)帶樣品的回收方法基本有四種：

　　a.穿刺法

　　穿刺離心管底部，使梯度溶液滴出，將一具有合適閥門的蓋帽放在離心管頂，可控制滴出速度。

　　b.虹吸法：